做實驗的小伙伴們都知道，與 DNA 相比，RNA 是極其脆弱的。這是由于 RNA 自身的不穩定性及 RNase 的穩定存在，使得 RNA 極易被分解。另外，與動物組織和培養細胞相比，植物組織的 RNA 更難提取。在完整的細胞內，上述物質與核酸是分離的；但在提取過程中細胞破裂，各種物質混雜在一起，容易干擾 RNA 的提取效果。接下來跟小編一起來看看RNA提取的正確操作吧~

1、使用正確的細胞或組織儲存條件

在樣品用液氮瞬間凍結之后，應該儲存在-80°C，千萬不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會導致RNA的降解和損失。瞬間凍結的組織應該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然后置于裂解液中進行勻漿。

RNAfixer使樣品儲存更為便利。儲存在RNAfixer中的細胞或組織可在室溫下穩定保存長達1個星期，在4°C可穩定保存長達1個月，或永久保存在-20°C。

2、消除環境RNase的污染

為了得到完整的、高品質RNA，在整個RNA制備過程中，當RNA離開強蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護時，避免引入新的RNase污染就非常關鍵。由于RNase幾乎是無所不在，所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣東西都是無RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作臺、玻璃器皿和制膠設備，都必須用表面去污凈化溶液如RNase噴霧清除劑 來處理過，去除各種溶液或者反應緩沖液中可能存在的RNase污染，可以用RNAsafe。必須保證一直使用無RNase的槍頭、試管和溶液，手套也應經常更換。

3、迅速滅活內源的RNA酶，以防止RNA降解

以下3個方法均可有效使內源RNA酶失活：

1）用含離液（如胍鹽）的細胞裂解液收獲樣品，并立即勻漿。

2）用液氮瞬間凍結樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間就能凍結，以確保瞬間令RNA酶失活。

3）立即將樣品置于RNAfixer無液氮RNA樣品儲存液中。它是一種水相、無毒的收集試劑，能立即穩定并保護完整、未凍結的組織和細胞樣品中的RNA。關鍵要點是組織樣品切片一定要夠?。?lt;0.5 cm），這樣RNAfixer才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。

4、選擇合適破壁方法

細胞或組織的徹底勻漿對RNA提取來說，是一個很關鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應根據細胞或組織的類型來選擇。大部分培養的細胞可以置于細胞裂解液中，通過簡單的渦旋震蕩來勻漿；而動物組織、植物組織、酵母和細菌、真菌則常常需要更加劇烈的方法，通常用液氮研磨。比如說細菌（特別是革蘭氏陽性菌）的細胞壁，就需要溶菌酶消化來實現徹底的細胞裂解和RNA的最大回收，酵母提取時加入破壁酶幫助破壁，再用TRIpure或RNApure進行提取。

5、不同材料如何選擇最適RNA提取試劑

現有眾多的RNA分離方法也許令人難以取舍。目前最簡單也是最安全的方法是柱式分離，如RNApure 因為操作簡單，時間短，純度高而受到大家的喜愛，RNApure不需要DNA酶消化DNA，節省了時間，避免RNA的降解，從而提高了產量；相對非柱式分離（如TRIzol），去除蛋白及其他雜質干凈，提高了純度，對于細胞、組織、一般植物均非常適合。植物RNA的提取比較難抉擇，植物RNA提取受酚、多糖、蛋白雜質、次生代謝物含量的影響，一般用TRIzol提取純度不高，而且很多植物用TRIzol提取不出來。

這時候可以選擇多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（水仙、辣椒、胡蘿卜、玉米、百合、小麥、西紅柿、花菜、油菜等）和通用植物RNA提取試劑盒（適合絕大多數植物提取，包括：各種中草藥、植物種子、蘋果、葡萄、草莓、香蕉、龍眼、荔枝、草坪植物、松樹、杉樹、白樺、紫松果、彩葉草、一品紅、夾竹桃、垂葉榕、紫羅蘭、月季、天竺藍、牽?；ǖ龋?；非常值得一提的是血液（包括血清、血漿、腦脊液、各種拭子或其他液體含量高的樣本）RNA的提取用TRIzol和紅細胞裂解的方法效果都不好，因為紅細胞裂解液不含有RNA酶的抑制成分，這個過程RNA很容易降解，推薦使用TRIpure LS (RP1101)或者血液總RNA提取試劑盒（RP4001），該方法適用于表達譜芯片實驗中RNA的提取，并成為博奧生物芯片北京國家工程研究中心的推薦方法：

6、低濃度RNA的沉淀

純化得到的RNA可能需要通過沉淀來濃縮，以滿足一些下游應用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀（加0.1體積的5M 醋酸銨、2-2.5體積的無水乙醇，-20°C放置25分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA ）的方法。核酸助沉劑是linear acrylamide，當RNA用于RT-PCR分析時，線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因為它們都不含DNA污染，糖原含量高會抑制PCR反應，應注意控制濃度，核酸助沉劑對PCR無影響，成為病毒核酸提取的首選。酵母RNA和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染，有可能影響RT-PCR的結果。沉淀后，注意避免RNA沉淀過分干燥，因為這可能導致很難重新溶解。

7、提取好的RNA如何儲存

如果只是短期儲存，重懸的RNA應放置于-20°C；如果是長期儲存的話，就應該放置于-80°C。儲存RNA時，可以加入少量的RNA酶抑制劑（RP5601），避免RNA的降解，RNA可以直接做下游實驗。如果要長期保存RNA，可以加入RNAlong。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會避免反復凍融損傷RNA，并預防偶然的RNase污染。