有關物質泛指在藥品的生產與儲存過程中產生的工藝雜質或降解產物。一個經過嚴格驗證的方法才能更有效地控制產品的純度，進而降低毒副作用的產生。我們對有關物質的控制方法一般為面積歸一化法、加校正因子的自身對照法和外標法。

 

《中國藥典》2015年版，在《藥品質量標準分析方法驗證指導原則》中新增了對校正因子的驗證，同時對驗證結果做了嚴格的規定?，F就加校正因子的自身對照法驗證方式和可接受范圍結合自身工作經歷提出一些看法，供大家參考。

 

1 專屬性

 

專屬性系指在其他成分（如雜質、降解產物、輔料等）存在下，采用的分析方法能正確測定被測物的能力。有關物質方法的專屬性實驗一般包括空白干擾實驗、系統適用性實驗和降解實驗三部分。

 

1.1 空白干擾實驗 國家食品藥品監督管理局藥品審評中心《藥品技術評價文集（第二輯）》要求空白無干擾，即空白溶劑或空白輔料不干擾本品有關物質的測定。 

 

1.2 系統適用性實驗 系統適用性實驗通常采取分離度實驗的方式進行評估，即根據已知雜質的限度配置限度濃度的加雜供試品溶液，考察已知雜質與供試品、各已知雜質及已知雜質與未知雜質間的分離度。要求各已知雜質與供試品及已知雜質間達到基線分離，已知雜質與未知雜質間的分離度大于1.0。 

 

1.3 降解實驗 將供試品在較為劇烈即在酸、堿、氧化、高溫（干熱和濕熱）、光照等條件下進行適當的降解進而考察方法的可行性。 

 

1.3.1 降解程度 RagineMaheswaran推薦的降解強度為5%～20%；《化學藥物分析方法驗證的內容和評價》中的推薦值為20%～30%；《國家藥品標準工作手冊》的推薦值為5%～10%。強制降解實驗是模擬藥品在生產、儲存和使用過程中的極端條件，現實中是極難發生的，同時如果過度降解極有可能造成二次降解致使物料不平衡故建議以低強度長時間（最長時間不建議超過七天，以三天內為宜）的方式進行降解實驗以最大可能地模仿現實條件，降解程度以5%～10%為佳，但是對于降解條件已較為劇烈卻仍未降解的建議不再加劇降解條件，如各條件均未產生降解產物的建議對相對較不穩定的條件加以復合條件進行進一步考察，以期望能有一條件出現降解產物以驗證方法的專屬性，如復合條件亦無降解產物產生則不再強求。 

 

1.3.2 分離度 參照系統適用性實驗要求，主峰與相鄰雜質峰達到基線分離，已知雜質與未知雜質及各未知雜質間分離度大于1.0。 

 

1.3.3 峰純度 峰純度主要是考察被分析峰中是否包含其他物質，現有儀器參數具有一定的局限性，無法完全真實地反應實際情況，參考現有儀器的表示方法建議規定主峰純度因子不小于990，或者純度閾值大于純度角。 

 

1.3.3 質量守恒 《國家藥品標準工作手冊（第四版）》與《藥品技術評價文集（第三輯）》中均要求在±10%以內，本人認為范圍過寬，如果排除人為誤差，單單考慮儀器的誤差將其定在±2%以內是比較合理的，但是考慮到降解程度為5%～10%，同時考慮到人為誤差、儀器誤差及校正因子因素，建議帶入校正因子后將其定為±5%是更合理的。

 

2 準確度

 

準確度系指采用該測定方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。驗證時一般要求根據有關物質的定量限與該雜質的限度分別配制三個濃度的供試品溶液各三份（如LOQ、50%、100%、150%）的同時配制自身對照溶液，按外標法和加校正因子的自身對照法分別測定其含量，將外標法測得值換算成百分含量與加校正因子的自身對照法的測量值進行比較以考察校正因子的準確度，將外標法的實測值與理論值比較，計算回收率，并計算回收率的相對標準偏差以考察方法的準確度。 

 

參照ICH Q3A的相關要求，并結合質量研究的實際情況，對校正因子的準確度擬定如下可接受范圍（X表示測得的雜質含量）： 

 

① 當X＜0.05%，兩測量值不做比較；

 

② 當0.05%≤X＜0.10%，兩測量值的差值在0.05%內；

 

③ 當0.10%≤X＜0.50%，兩測量值的差值在0.10%內；

 

④ 當X≥0.50%，兩測量值的差值在0.20%內。 

 

《藥品技術評價文集（第二輯）》中規定各濃度下的平均回收率應在80%～120%，LOQ濃度下的平均回收率應在70%～130%，RSD不大于10%，此范圍過于寬泛，而2015年版《中國藥典》要求過于苛刻，極難達到，結合實際工作，對方法的準確度實驗擬定如下可接受范圍： 

 

① LOQ濃度水平，每個樣品的回收率均在85%～110%；

 

② LOQ以上濃度水平，每個樣品的回收率均在92%～105%；

 

③ 含LOQ濃度各樣品回收率的RSD應不大于10%，LOQ濃度水平以上的各樣品回收率的RSD應不大于5%。

 

3 精密度

 

精密度系指在規定的條件下，同一份均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度稱為重復性；在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結果之間的精密度，稱為中間精密度。 

 

  一般我們采用加限度雜質濃度的供試品溶液，平行配制6份，按外標法和加校正因子的自身對照法分別測定已知雜質的含量。

 

校正因子的重復性和中間精密度擬定可接受標準為（X表示測得的雜質含量）： 

 

① 當X＜0.05%，兩測量值不做比較；

 

② 當0.05%≤X＜0.10%，兩測量值的差值在0.05%內；

 

③ 當0.10%≤X＜0.50%，兩測量值的差值在0.10%內；

 

④ 當X≥0.50%，兩測量值的差值在0.20%內。

 

  《藥品技術評價文集（第二輯）》中規定重復性RSD不大于15%，重復性和中間精密度12份數據RSD不大于20%，范圍過于寬泛。參照2015年版《中國藥典》通則9101的精密度和ICH Q3A的相關要求，并結合實際工作，擬定可接受標準為： 

 

① 當X＜0.05%，不計算RSD；

 

② 當0.05%≤X＜0.10%，RSD不得過4，不同實驗人員測得值得RSD不得過8或差值不得過0.05%；

 

③ 當0.10%≤X＜0.50%，RSD不得過3，不同實驗人員測得值得RSD不得過6或差值不得過0.10%；

 

④ 當X≥0.50%，RSD不得過2，不同實驗人員測得值得RSD不得過4或差值不得過0.20%。

 

4 線性

 

  系指在設計的范圍內，測定響應值與試樣中被測物濃度呈比例關系的程度。應在規定的范圍內測定線性關系?？捎猛粚φ掌焚A備液經精密稀釋，或分別精密稱取對照品，制備一系列對照品溶液的方法進行測定，至少制備5份不同濃度的對照品溶液。線性濃度溶液建議從定量限至限度濃度的200%。每份樣品溶液進樣一針， 以測得的響應信號對被測物的濃度作圖進行線性回歸，列出線性方程、線性圖、相關系數、響應因子、y軸峰面積的截距及剩余標準偏差。 

 

《藥品技術評價文集（第二輯）》中規定相關系數不小于0.990，y軸截距應在100%峰面積的25%以內，響應因子的RSD不大于10%；《2010年版-實驗室控制系統GMP實施指南》中規定相關系數原料不小于0.998、制劑不小于0.990，y軸截距應在100%峰面積的25%以內，當限度小于0.5%時剩余標準偏差不大于10%。結合現有研發實際經驗，擬定如下標準：

 

① 相關系數不小于0.999

 

② y軸截距不大于100%濃度峰面積的10%

 

③ 響應因子的RSD不大于5%

 

④ 剩余標準偏差不大于10% 

 

  根據線性方程的斜率（k）比計算校正因子。即校正因子=k主成分/k雜質。其可接受標準為： 

 

① 校正因子在0.9～1.1之間修約為1.0，當其小于0.9時保留小數點后兩位，當其大于1.1時保留小數點后一位,另有規定的除外；

 

② 當校正因子為法定標準收載的，偏差在10%以內取法定標準數值，若偏差大于10%應考察其原因，經分析為非方法和人為誤差引入的，則按實際測定值作為校正因子；

 

③ 當校正因子在0.2～5.0之外時需要考察方法是否需要可行或更換為雜質外標法。

 

5 定量限與檢測限

 

  定量限（LOQ）是指試樣中被測物能被定量測定的最低值；檢測限（LOD）是指試樣中被測物能被檢測出的最低量。方法分為直觀法、信噪比法和基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法。 

 

  我們最常使用的是信噪比法，本人更推薦直觀法，因為其更簡單直接，只要靈敏度足夠好，直觀法更有利于操作的簡便性和驗證項目的通過（如定量限回收率的測定）?，F就常用的信噪比法擬定如下標準：

 

① LOD和LOQ的信噪比分別擬定為2～4和8～12，在保證靈敏度的情況下可以將其適當放寬至2～6和8～15；

 

② LOQ濃度樣品連續進樣6次峰面積的RSD不得過10%

 

③ LOQ一般為限度濃度的十分之一，最差為限度濃度的二分之一同時滿足低于報告限濃度，考慮到常規藥品的最大日劑量是小于2g的現狀，LOQ應小于供試品溶液濃度的0.05%。

 

6 耐用性

 

系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的成熟程度。 

 

6.1 溶液穩定性 

 

 一般我們需要對供試品溶液、對照品溶液及對照溶液進行穩定性考察，考察時間取決于實際樣品檢測最長時間、方法學驗證項目中耗時最長項目時間（一般為耐用性）及溶液是否出現不穩定性。對于溶液穩定性小于4h的樣品應臨用新制并立即進樣，低于2h的應考慮更換溶劑、改變放置條件（如進樣盤控溫）或更改檢測方法。 

 

對于對照品及對照溶液建議采用主成分峰面積RSD不大于2%進行判斷。對于供試品溶液由于其雜質含量差異較大，如按照峰面積RSD不大于2%進行判斷顯然是不合理的，對其建議采用面積歸一化法進行判斷，并符合以下標準即認為供試品溶液是穩定的（X為面積歸一化法計算雜質的含量）： 

 

① 當X＜0.05%，兩測量值不做比較；

 

② 當0.05%≤X＜0.10%，兩測量值的差值在0.05%內；

 

③ 當0.10%≤X＜0.50%，兩測量值的差值在0.10%內；

 

④ 當X≥0.50%，兩測量值的差值在0.20%內。

 

6.2 耐用性試驗 

 

一般選擇對3～5個相關的測定條件進行微小的變動，一般對下列條件進行微小的改變，流動相比例（±5%，如為兩項預混流動相，則起始比例的改變不得超過低比例流動相的10%）、pH值（±0.2）、波長（±2nm）、不同品牌或同一品牌不同批次的同類型色譜柱、緩沖鹽濃度（±5nmol）、柱溫（±5℃）、流速（±0.1ml/min）等。按照常規實驗要求取空白干擾溶液、系統適用性溶液、對照品溶液、供試品溶液、對照溶液等進樣，考察色譜條件微小改變后空白干擾現象、系統適用性（以分離度為主，拖尾因子、理論板數等為輔）及各雜質的含量的變化情況。 

 

 校正因子的耐用性結果良好結果要求參照精密度項下要求即以外標法和加校正因子自身對照法計算雜質含量（X）應符合以下要求 

 

① 當X＜0.05%，兩測量值不做比較；

 

② 當0.05%≤X＜0.10%，兩測量值的差值在0.05%內；

 

③ 當0.10%≤X＜0.50%，兩測量值的差值在0.10%內；

 

④ 當X≥0.50%，兩測量值的差值在0.20%內。 

 

耐用性實驗結果良好，需滿足一下標準：

 

① 空白溶劑或輔料不干擾本品有關物質的測定；

 

② 系統適用性溶液中各已知雜質與供試品及已知雜質間達到基線分離，已知雜質與未知雜質間的分離的大于1.0；

 

③ 按加校正因子的自身對照法計算所得雜質的含量（X）滿足校正因子的耐用性實驗結果良好的要求。

 

7 范圍

 

系指分析方法能達到一定精密度、準確度和線性要求時的高低限濃度或量的區間。即范圍由精密度、準確度和線性的結果所決定。2015年版《中國藥典》規定是限度的±20%；ICH Q2規定是報告限到限度的120%或者是LOD或LOQ到限度；USP40的規定是限度的50%至120%。而范圍一般是由線性研究所得，考慮到常規原料與制劑的限度區別同時為了減少工作量，故建議線性范圍為LOQ至原料限度的300%。